คลังผลงานวิจัย กรมวิชาการเกษตร

รายงานผลงานวิจัยและพัฒนา

การถ่ายยีน ERD15 ที่อยู่ในรูป RNAi เข้าสู่พืชต้นแบบ (ยาสูบ) และศึกษาการแสดงออกของยีน

คำหลัก :

ผู้วิจัย : พยุงศักดิ์ รวยอารี

ผู้ร่วมวิจัย : อรุโณทัย ซาววา, ภรณี สว่างศรี, บุญเรือนรัตน์ เรืองวิเศษ

หน่วยงาน : สำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ

ปี: 2560

ประเภทผลงาน: ผลงานวิจัยเรื่องเต็ม

จำนวนผู้อ่าน: 19 ครั้ง

บทคัดย่อ (Abstract)

          ปัจจุบัน พืชประสบปัญหาสภาวะขาดน้ำจากสภาวแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม เทคโนโลยี RNA interference (RNAi) ได้ถูกนำมาใช้ในการเพิ่มคุณสมบัติของพืชให้มีลักษณะทนแล้งโดยใช้ยีนทนแล้งต่างๆ งานวิจัยนี้ ได้ออกแบบเวคเตอร์ pRNAi-GG plant expression vector ที่ประกอบด้วยยีน ERD15 ในทิศทาง sense และ antisense ที่ประกอบด้วยยีนอินทรอน pdk คั่นกลาง และยีน ccdB (lethal gene) ถูกแทนที่ด้วย ERD15 โดยอาศัยวิธีการ One tube restriction-ligation method เมื่อตัดด้วยเอนไซม์ BsaI และเชื่อมต่อด้วยเอนไซม์ T4 DNA ligase ตามวิธีการของ Pu Yan et al. 2012 ออกแบบและสังเคราะห์ยีน ERD15 ให้มีขนาดเท่ากับ 609 คู่เบส เติมจุดตัด BsaI ที่ด้านปลาย 5’ และ 3’ ของยีน บนพลาสมิดเวคเตอร์ pRNAi-GG (Golden gate vector) ที่ประกอบด้วยตำแหน่งไพรเมอร์จำเพาะเพื่อใช้ในการคัดเลือกทรานส์ฟอร์แมนส์และโครงสร้าง RNAi ที่ได้ประกอบด้วยทั้ง CaMV35S promoter และ Nos terminator ศึกษาควบคุมการทำงานของยีนในลักษณะการยับยั งการทำงานของยีน ERD15 (gene silencing) เมื่อ ccdB lethal gene ถูกแทนที่ด้วยยีน ERD15 ทั้งทิศทาง sense และ antisense ตรวจสอบผลการแทรกแซงของยีน ERD15 ในคอนส์ตรักส์ โดยการหาลำดับเบสและโดยการใช้ไพรเมอร์จำเพาะทิศทาง ผลการทดลองพบว่า ได้ยีน ERD15 ที่อยู่ใน pRNAiGG + ERD15 จำนวน 100% (12 โคโลนี จาก 12 โคโลนี) จากนั้นถ่ายฝากพลาสมิด pRNAi-GG ที่ประกอบด้วยยีน ERD15 (pRNAi+ERD15 construct) เข้าสู่คอมพิเทนต์เซลล์ E. coli เพื่อเพิ่มจำนวน โดยวิธี Electroporation ผลจากการตรวจสอบทรานส์ฟอร์แมนส์ พบว่าลำดับกรดอะมิโนของ ERD15 มีลำดับเบสคล้ายคลึงอย่างสูงกับ ERD15 ของ Arabidopsis thaliana และได้ ihpRNAi + GG คอนส์ตรักส์ที่ประกอบด้วยยีน ERD15 ทั้งทิศทาง sense และ antisense ที่ถูกต้อง ทำการทดลองระหว่างปี 2559 ถึง 2560 ณ สำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ จากนั้น ทำการเพาะเลี ยงเนื อเยื่อต้นยาสูบ เพื่อทำการถ่ายฝากยีน ERD15 โดยอาศัยวิธีการ Agrobacterium transformation เข้าสู่เชื้ออะโกรแบคทีเรียม ElectroMAX LBA4404 และ A10460 ผลการทดลองในเบื้องต้น พบว่า ทรานส์ฟอร์แมนส์ที่ถ่ายฝากเข้าสู่เชื้อ Agrobacterium A10460 ได้ค่อนข้างสูง ซึ่งเป็นไปตามทฤษฎี โดย A10460 มีคุณสมบัติต้านทานต่อยีน ccdB แต่ประสิทธิภาพการการถ่ายฝากยีน ERD15 เข้าสู่ต้นพืชยาสูบค่อนข้างต่ าเมื่อใช้ LBA4404 โดยทรานส์ฟอร์แมนส์ไม่สามารถเติบโตเป็นแคลลัสได้จากการถ่ายฝากยีน แต่การทดลองควบคุม (control experiments) โดยอาศัยใบของต้นยาสูบ ประสบความสำเร็จ 100% สรุปได้ว่า ต้องศึกษาโดยใช้ Agrobacterium สายพันธุ์อื่นๆ พร้อมกับทำการปรับหาสภาวะที่เหมาะสมในการถ่ายฝากยีน ERD15 ในรูปพลาสมิด ihpRNAI + GG ด้วยวิธี ELECTRO agrobacterium transformation เพื่อให้ได้ต้นยาสูบที่ประกอบด้วยยีน ERD15 เพิ่มเติมต่อไป

URL Reference :

(ดาวน์โหลด: 15 ครั้ง)

ปรับปรุงข้อมูลเมื่อวันที่ 29-07-2568

แจ้งไฟล์หาย