คลังผลงานวิจัย กรมวิชาการเกษตร

รายงานผลงานวิจัยและพัฒนา

การใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อพัฒนาพันธุ์พืช จุลินทรีย์ และผลิตภัณฑ์

คำหลัก : การถ่ายยีน หน้าวัว องุ่น ข้าวโพดข้าวเหนียว สาหร่าย ยีนควบคุมสีดอก เซลลูเลส ชีวมวล เห็ด สารออกฤทธิ์ทางชีวภาพ เชื้อแบคทีเรีย ราเขียว สัณฐานวิทยา ไลเปส การแสดงออกของยีน การแยกและการสกัดไลเปส คุณลักษณะของไลเปส ไบโอดีเซล ไคติเนส ไบโอเอทานอล พืชพลังงาน พลังงานทดแทน ยางพารา องุ่น ลายพิมพ์ดีเอ็นเอ ไซลาเนส ชีวมวล ไซแลน เฮมิเซลลูโลส เครื่องหมายโมเลกุล ความหลากหลายทางพันธุกรรม กล้วยไม้รองเท้านารี

ผู้วิจัย : รุ่งนภา พิทักษ์ตันสกุล

ผู้ร่วมวิจัย : บุญเรือนรัตน์ เรืองวิเศษ, กรกช จันทร, หทัยรัตน์ อุไรรงค์, มัทนา ศรีหัตถกรรม, วิภา หงษ์ตระกูล, กิ่งกาญจน์ พิชญกุล, ภรณี สว่างศรี, อัจฉราพรรณ ใจเจริญ, รุ่งนภา พิทักษ์ตันสกุล, สุภาวดี ง้อเหรียญ, อรุโณทัย ซาววา, ศรีเมฆ ชาวโพงพาง, มัลลิกา แก้ววิเศษ, อัจฉราพรรณ ใจเจริญ, เสาวนิตย์ โพธิ์พูนศักดิ์, จีรภา ปัญญศิริ, กุหลาบ คงทอง, ประสาน สืบสุข, กัลยา เกาะกากลาง, จีราพร แก่นทรัพย์, กรรณิการ์ ธีระวัฒนสุข, รัชนี รัตนวงศ์, ขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์, กิตติภพ วายุภาพ, วราพร ไชยมา, อัครชาพรรณ กวางแก้ว, นุกูล อ่อนนิ่ม, กุลธิดา ดอนอยู่ไพร, เยาวภา เต้าชัยภูมิ, วิลาวรรณ ไชยบุตร และศิริลักษณ์ อินทะวงศ์

หน่วยงาน : สำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ สำนักวิจัยพัฒนาการอารักขาพืช ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ศูนย์วิจัยและพัฒนาการเกษตรลำปาง ศูนย์วิจัยยางฉะเชิงเทรา ศูนย์วิจัยยางหนองคาย ศูนย์วิจัยพืชไร่ชัยนาท ศูนย์เทคโนโลยีสารสนเทศและการสื่อสาร สานักวิจัยและพัฒนาการเกษตรเขตที่ 2 และศูนย์วิจัยและพัฒนาการเกษตรที่สูงเพชรบูรณ์

ปี: 2558

ประเภทผลงาน: --------

จำนวนผู้อ่าน: 7 ครั้ง

บทคัดย่อ (Abstract)

          การใช้เทคโนโลยีชีวภาพเพื่อพัฒนาพันธุ์พืช จุลินทรีย์ และผลิตภัณฑ์ เป็นโครงการที่เริ่มดำเนินการตั้งแต่ปี 2554 - 2558 โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อรวบรวม พัฒนา และค้นหาสารสำคัญของจุลินทรีย์เพื่อไปใช้ประโยชน์ทางการเกษตร ได้แก่ แบคทีเรีย รา ยีสต์ และสาหร่ายขนาดเล็ก นอกจากนี้ค้นหาสารยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์สาเหตุโรคพืช และจุลินทรีย์ที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตต่อพืช เพื่อการถ่ายยีนและการแสดงออกของยีน dihydroflavonol 4-reductase (DFR) ในรูป antisense เพื่อสร้างความหลากหลายของสีดอกหน้าวัว เพื่อค้นหาตำแหน่งการเกิดเครื่องหมายดีเอ็นเอ SNP ในจีโนมยางพารา และใช้เครื่องหมายโมเลกุลเพื่อให้ได้ข้อมูลที่สามารถระบุความใกล้ชิดทางพันธุกรรม สำหรับใช้ประกอบการคัดเลือกพ่อแม่พันธุ์ที่เหมาะสมในการปรับปรุงพันธุ์ข้าวโพดข้าวเหนียว และเพื่อศึกษาความหลากหลายทางพันธุกรรมและความสัมพันธ์ที่ได้จากการทำลายพิมพ์ดีเอ็นเอเห็ด องุ่น และกล้วยไม้รองเท้านารีในประเทศไทย ซึ่งเป็นจุลินทรีย์และพืชที่นำมาศึกษาที่มีความสำคัญทางเศรษฐกิจของประเทศไทย วิธีการศึกษาโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพเข้ามาช่วยปรับปรุงและพัฒนาให้ได้สายพันธุ์ใหม่ ซึ่งเทคนิคทางชีวโมเลกุลที่นำมาใช้ได้แก่ การจำแนกชนิดของเชื้อจุลินทรีย์ ได้แก่ แบคทีเรีย เชื้อรา และสาหร่ายขนาดเล็ก โดยวิเคราะห์ความแตกต่างทางพันธุกรรมในส่วนของ rDNA sequence การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับเอนไซม์เซลลูโลส ไซแลน ไลเปส waxy gene เข้าสู่เวคเตอร์ และศึกษาการแสดงออกของยีนที่ถ่ายเข้าสู่แบคทีเรีย ยีสต์ สาหร่าย และยีน dihydroflavonol 4-reductase (DFR) ในรูป antisense ในดอกหน้าวัว นอกจากนี้การปรับปรุงพันธุ์ยางพาราโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ SNP และการประเมินลักษณะทางพันธุกรรมข้าวโพด องุ่นและกล้วยไม้รองเท้านารี โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR หรือ Microsatellite และจัดกลุ่มเพื่อแยกความแตกต่างของแต่ละสายพันธุ์ เพื่อนำไปใช้ปรับปรุงพันธุ์ต่อไป ซึ่งผลการทดลองพบว่า สามารถโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายชีวมวลจำนวน 3 ยีน ได้แก่ endo glucanase, cellobiohydrolase และ beta-D-glucosidase ใส่ในเวคเตอร์ pPICZA pPICZB และ pPICZC ซึ่งเป็นเวคเตอร์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมในการถ่ายลงเซลล์แบคทีเรีย ได้แก่ E .coli และยีสต์ Pichia pastoris นำยีสต์ที่มียีนนั้นไปเลี้ยงเพิ่มปริมาณในอาหาร YPD + Zeocin และเลี้ยงกระตุ้นการแสดงออกของยีนในอาหาร MGYH และกระตุ้นโดยการเติมเมทานอลพบว่า ยีสต์ที่ได้สามารถผลิตโปรตีนได้มีขนาด 45, 25 และ 15 กิโลดาลตัน ตามลำดับ สามารถถ่ายฝากยีนไลเปส 4 ยีน ได้แก่ lip ของ P. aeruginosa, lip A ของ S. marcescens, lip A ของ B. subtilis และ alkaline lip ของ B. cepacia เข้าใน pET TOPO เวคเตอร์และเหนี่ยวนำให้มีการแสดงออกของยีนใน BL21 ได้ไลเปสของ B. subtilis มีประสิทธิภาพในการย่อยน้ำมันปาล์มอย่างสมบูรณ์ น้ำมันที่ได้ใสสะอาด เมื่อนำไปผลิตไบโอดีเซลได้ไบโอดีเซล B100 สามารถโคลนยีนและถ่ายฝากยีนไคติเนสของแบคทีเรียเข้าใน pET 100/D-TOPO vector ได้ 6 ยีน และโคลนยีนราได้ 1 ยีน และพบว่ามีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของราโรคพืช 3 เชื้อ ได้แก่ Botryodiplodia theobromae, Pyricularia oryzae และ Fusarium oxysporum และสามารถยับยั้งการงอกของสปอร์ราโรคพืชได้อย่างสมบูรณ์ การทดสอบประสิทธิภาพของเชื้อเห็ด 6 ชนิด 10 ตัวอย่าง ทดสอบด้วยวิธี Dual cultures พบว่าเห็ดแต่ละชนิดมีประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของเชื้อราโรคพืชในแต่ละชนิดที่แตกต่างกัน นอกจากนี้ จำแนกชนิดสาหร่ายขนาดเล็กโดยใช้เทคนิคทางชีวโมเลกุลในส่วนของ rDNA โดยใช้ไพรเมอร์ 11 คู่ พบว่าสาหร่าย Chlorella pyrenoidosa (ADOA4) มีการเจริญเติบโตได้รวดเร็วที่สุด ที่ pH 7 - 8 สามารถขยายและเลี้ยงในสภาพกลางแจ้งได้ในอ่างพลาสติกขนาด 600 ลิตร เก็บเกี่ยวเซลล์ได้ในวันที่ 4 - 8 ได้น้ำหนักเฉลี่ย 1.65 กก.น้ำหนักแห้ง/ลบ.ม. และสามารถคัดเลือกสาหร่ายขนาดเล็กที่มีปริมาณแป้งสูงจากการโคลนยีน waxy (Wx gene) เข้าสู่ pChlamy_3 vector และถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์สาหร่าย Chlamydomonas reinhardtii ได้จึงเป็นชนิดที่เหมาะสมในการคัดเลือกไปเพิ่มปริมาณและศึกษาเทคโนโลยีการผลิตเป็นไบโอเอทานอลต่อไป สามารถรวบรวมและคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสและไซลาเนสบนอาหาร screening medium ซึ่งมี CMC-Na และ Xylan เป็นองค์ประกอบ จำนวนทั้งสิ้น 488 ไอโซเลท เชื้อแบคทีเรียที่สามารถย่อยเซลลูโลสได้ดี คือ ไอโซเลท AC-10 ให้ค่า reducing sugar สูงที่สุด เท่ากับ 1,350 ug/ml ส่วนเชื้อแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการย่อยสลายเฮมิเซลลูโลสได้ดี คือ ไอโซเลท PV4-15x ให้ค่า reducing sugar สูงที่สุด เท่ากับ 3,360 ug/ml จำแนกชนิดแบคทีเรียโดยวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ มีความคล้ายคลึงกับเชื้อ Streptomyces sp. และ Bacillus amyloliquefaciens การโคลนยีนไซลาเนส (endo-1,4-beta-xylanase gene) ทำการเชื่อมต่อชิ้นยีนไซลาเนสเข้ากับ Expression Vector (aLICator LIC Cloning and Expression system) แล้วถ่ายฝากพลาสมิดดีเอ็นเอสายผสมของยีนไซลาเนส เข้าสู่เซลล์ E. coli สายพันธุ์ BL21 (DE3) พบว่า รีคอมบิแนนท์เอนไซม์มีกิจกรรมที่ดีเมื่อเทียบกับชุดควบคุม E. coli BL21 (DE3) ที่ไม่ได้รับการถ่ายยีน สำหรับการศึกษาเอนไซม์เซลลูเลส ได้เก็บรวบรวมเชื้อราทั้งหมด 32 สายพันธุ์ นำมาทดสอบความสามารถในการย่อยสลายเฮมิเซลลูเลสพบว่า มี 10 สายพันธุ์ที่สามารถย่อยสลายเฮมิเซลลูโลสได้ดีบนอาหารทั้ง 4 ชนิด ได้แก่ CMC เปลือกข้าวโพด เปลือกมัน และอากาเว่ ด้านการโคลนยีน เมื่อมีการเลี้ยง E. coli BL21 (DES 3) ที่พลาสมิดสายผสม pET160/GW/D-TOPO มียีน B-D–xylosidase ได้แก่ XldC1, Xld2C1 และ XldC4 ที่กระตุ้นให้มีการแสดงออกของโปรตีนที่ 4 ชั่วโมง ในอาหารเลี้ยงเชื้อแบบเติมและแบบไม่เติม IPTG พบว่ามีการย่อยบนอาหารไซเลน ข้าวโพด และอากาเว่ได้ดี ในขณะที่มีการย่อยได้น้อยมากบนอาหารที่ผสมเปลือกมัน และไม่เกิดการย่อยบนอาหาร CMC เลย ซึ่งผลจากการเลี้ยงเชื้อ แบบเติมและแบบไม่เติม IPTG พบว่า ให้ผลการย่อยเคลียร์โซนบนอาหารที่มีส่วนผสมของไซเลน อากาเว่ และข้าวโพดที่ไม่แตกต่างกัน ในเรื่องของกระบวนการหมักไบโอเอทานอล สามารคัดเลือกยีสต์ที่ได้รับการถ่ายยีน yap1  ซึ่งเป็นยีนที่มีส่วนสำคัญในการกำจัดสารพิษของยีสต์เข้าสู่จีโนมของยีสต์และได้ยีสต์ดัดแปลงพันธุกรรมที่มีอัตตราการเจริญเติบโตสูงและเร็วกว่ายีสต์ WT นอกจากนี้ยีสต์ดัดแปลงพันธุกรรมที่ได้สามารถทนทานต่อสารปฏิชีวนะ Cycloheximide และทนทานต่อสารมีพิษ HMF และสร้างชุดการสังเคราะห์ Over expression vector สำหรับ Cellulase Enzymes พร้อมใช้เพื่อถ่ายเข้าสู่ยีสต์ในการนำไปใช้ย่อยสลายวัสดุเหลือใช้ทางการเกษตรได้ นอกจากนี้ได้คัดเลือกและเก็บรักษาแบคทีเรียทนเย็นได้ 5 สกุล สามารถโคลนยีนแบคทีเรียได้ 3 ยีน คือ Neub family protein with antifreeze-like domains จาก Bacillus cereus ขนาด 984 nucleotides และ antifreeze glycopeptide AFGP related protein จาก Xanthomonas campestris pv. Campestris ขนาด 1887 nucleotides และ afpIII จากปลาน้ำลึก Macrozoarces americanus clone15typeIII 1 ยีน ขนาด 267 nucleotides และ X. campestris ขนาด 8, 30.4 และ 58.3 KDa ตามลำดับ โปรตีนต้านการเกิดผลึกน้ำแข็งที่ผลิตได้จากการทดลองนี้ สามารถลดความเสียหายเนื่องจากการแช่แข็งได้อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับเชื้อราเขียวที่ป้องกันแมลง สามารถจำแนกเชื้อราเขียวที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีทั้งหมด 14 ตัวอย่าง ซึ่งจากการจำแนกเบื้องต้นพบว่าเป็น Metarhizium anisopliae 11 ตัวอย่าง M. flavoride 1 ตัวอย่าง และ Metarhizium spp. 2 ตัวอย่าง สามารถจำแนกและวิเคราะห์ข้อมูลเห็ดเรืองแสงโดยวิธีหาลำดับเบสบริเวณ ITS ของเห็ดเรืองแสง 4 ชนิด พบว่าเป็นชนิด Mycena chlorophos และ Neonothopanus nimbi อีก 2 ชนิดสามารถจำแนกได้เพียง genus คือ Favolaschia spp. และ Mycena spp. สามารถนำไปถ่ายฝากสู่หน้าวัวพันธุ์โซเนตและพันธุ์ราปิโด จากการคัดเลือกต้นหน้าวัวที่ได้รับการถ่ายยีนในอาหารที่เติม hygromycin และนำไปตรวจสอบด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ไพรเมอร์ที่จำเพาะ พบว่าการถ่ายฝากยีน DFRAS เข้าสู่หน้าวัวประสบผลสำเร็จ ได้ทำการค้นหาตำแหน่งการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสแบบสนิปของยีนในยางพารา 12 พันธุ์ เพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอของยีน 9 ยีน นำไปวิเคราะห์ลำดับเบส พบว่ามีการเปลี่ยนแปลงเบสแบบสนิปรวม 90 ตำแหน่ง สามารถวิเคราะห์การจัดกลุ่มความเชื่อมโยงได้ทั้งหมด 18 กลุ่ม ซึ่งตรงกับจำนวนชุดจีโนมของยางพารา การเปลี่ยนแปลงลำดับเบสแบบสนิปที่พบจัดเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอที่สามารถนำไปประยุกต์ใช้กับการปรับปรุงพันธุ์ยางพารา และนำไปใช้สร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอเพื่อระบุความเป็นเอกลักษณะของยางพาราแต่ละพันธุ์ได้ การใช้เครื่องหมายโมเลกุลไมโครแซทเทลไลท์เพื่อประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมในระดับ ดีเอ็นเอของข้าวโพดข้าวเหนียว 186 สายพันธุ์ ทำให้การจัดแบ่งกลุ่มความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมได้เป็น 5 กลุ่ม ความแตกต่างทางพันธุกรรมของข้าวโพดด้วยผลของการใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR จึงเป็นประโยชน์สำหรับการปรับปรุงพันธุ์ข้าวโพด และเป็นเอกลักษณ์ประจำพันธุ์เพื่อเป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับตรวจสอบพันธุ์ข้าวโพด ทำประเมินลักษณะพันธุกรรมขององุ่น 63 พันธุ์ การทำลายพิมพ์ดีเอ็นเอด้วยเครื่องหมายโมเลกุลชนิด Microsatellite primer 28 คู่ พบว่าสามารถแบ่งพันธุ์องุ่นออกเป็น 2 กลุ่มที่แตกต่างกันอย่างชัดเจนคือ กลุ่ม A เป็นองุ่นรับปะทานสดทั้งหมด กลุ่ม B เป็นองุ่นทำไวน์และองุ่นป่ารวมถึงองุ่นรับประมานสดอีก 6 พันธุ์ นอกจากนั้น การศึกษาครั้งนี้ได้มีการเขียนโปรแกรมจัดทำฐานข้อมูลพันธุ์ดีเอ็นเอของพันธุ์องุ่นขึ้น เครื่องมือที่ใช้ในการพัฒนาระบบหรือเขียนโปรแกรมใช้ Miorosulf Visual Studio 2005 และโปรแกรมฐานข้อมูล MS-SQL Serer Express ASP.Net 2.0 ติดตั้งบน Internet ค านำ Insormation Serviec ภาษาที่ใช้ในโปรแกรมนี้ คือ ASP.Net 2.0 ส่วนกล้วยไม้รองเท้านารีที่เก็บรวบรวมไว้ โดยการประยุกต์ใช้เครื่องหมายโมเลกุล SSR ที่พัฒนาจากกล้วยไม้สกุลแวนด้ากับกล้วยไม้สกุลรองเท้านารี เพื่อลดค่าใช้จ่าย ศึกษาไพรเมอร์ทั้งหมดจำนวน 101 คู่สาย กับกล้วยไม้สกุลรองเท้านารี 25 ตัวอย่าง จาก 12 สายพันธุ์ พบว่ามี 61 คู่สายไพรเมอร์ ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ แบ่งกลุ่มความสัมพันธ์ได้เป็น 2 กลุ่ม กลุ่มที่ 1 ได้แก่ รองเท้านารีขาวพังงา รองเท้านารีขาวสตูล รองเท้านารีเหลืองปราจีน รองเท้านารีเกรยี่ และรองเท้านารีฝาหอย กลุ่มที่ 2 ได้แก่ รองเท้านารีเหลืองกระบี่ และไม้ป่าเกาะพนัก นอกจากนี้ได้มีการทำฐานข้อมูลของกล้วยไม้รองเท้านารี จัดเก็บในรูปแบบสื่ออิเลคทรอนิคส์ออนไลน์เพื่อให้ง่ายต่อการใช้งานของบุคคลทั่วไป และมีการออกแบบไว้เพื่อให้ผู้นำไปใช้สามารถปรับปรุงข้อมูลให้เป็นปัจจุบันได้อย่างง่าย โดยมีการเปิดให้ทดลองใช้ผ่านทาง http://www.plc.rmutl.ac.th/Database/result.php

URL Reference :

(ดาวน์โหลด: 4 ครั้ง)

ปรับปรุงข้อมูลเมื่อวันที่ 16-08-2563

แจ้งไฟล์หาย